‘Whole Genome Sequencing’ van bacteriën binnen handbereik van voedingsbedrijven

Dankzij de snelle evoluties in nanotechnologie en bio-informatica kan je het genoom van een bacterie nu al in minder dan één dag uitlezen. Daarmee is ‘Whole Genome Sequencing’ een praktische methode geworden om individuele bacteriën snel te identificeren. Daarenboven kan uit de genoomdata heel wat afgeleid worden over de specifieke eigenschappen van een geïsoleerde bacterie. Dat alles maakt het interessant voor voedingsbedrijven om deze technologie te integreren in hun kwaliteitscontroles of productontwikkeling (in het bijzonder van gefermenteerde levensmiddelen). Met de opkomst van draagbare ‘nanopore’ sequencing apparatuur komt ‘Whole Genome Sequencing’ meer en meer binnen het handbereik van voedingsbedrijven. Maar in deze snelle technologie durven er soms foutjes te sluipen. Kunnen bacteriën zo op een betrouwbare manier tot op stamniveau geïdentificeerd worden? Dat kan belangrijk zijn indien men deze technologie wil inzetten voor bijvoorbeeld het achterhalen van besmettingsroutes en -bronnen in een productieomgeving. Om hier inzicht in te krijgen werden in het SIPORE-project de mogelijkheden onderzocht voor twee belangrijke voedselpathogenen: Listeria monocytogenes en Salmonella (verschillende serovars). 

Nanopore DNA-sequentieanalyse  

DNA-sequentieanalyse is het proces waarbij de nucleotidevolgorde van een DNA-streng wordt vastgesteld. Nanopore-sequentieanalyse is een technologie die zowat 10 jaar geleden ontwikkeld werd en directe, real-time analyse van lange DNA-fragmenten (> 10.000 nucleotiden) mogelijk maakt. Enkelstrengig DNA wordt daarbij door kleine poriën geleid ('nanoporen' genaamd). De passerende DNA-strengen veroorzaken kleine variaties in de elektrische stroom die door de nanopore stroomt. Door deze variaties te meten, bepaalt men de nucleotidevolgorde (Figuur 1). Via bio-informatica algoritmes worden de DNA-sequenties van de fragmenten samengesteld tot één genoomsequentie.
 

Van bacterie tot ‘Whole Genome Sequence’

De praktische uitvoering van nanopore DNA-sequentieanalyse bestaat uit twee delen: praktisch labowerk (van staalvoorbereiding tot opstart van de DNA-sequentieanalyse) en een data-analyse met bio-informatica. Voor het eerste deel werd in SIPORE een protocol geoptimaliseerd dat volgende stappen omvatte: DNA extractie (van geïsoleerde bacteriën), ‘DNA end-repair’, ‘adapter ligation & cleanup’ en het laden van de ‘flow cell’.

Voor het tweede deel werden ‘pipelines’ ontwikkeld waarin verschillende algoritmes getest werden voor de verschillende stappen om tot een ‘Whole Genome Sequence’ te komen. Er werden verder ook aangepaste protocols getest die het mogelijk maken om tot 20 stalen tegelijkertijd te analyseren. Hierbij werd duidelijk dat je daarbij een afweging moet maken tussen efficiëntie (het aantal stalen dat je tegelijkertijd wil analyseren) en de betrouwbaarheid die je wenst na te streven.  

Van ‘Whole Genome Sequence’ tot identificatie en meer…

De bekomen genoomsequenties werden vergeleken met databanken. Zo bestaan er voor Listeria monocytogenes databanken op zeer gedetailleerd stamniveau (cgMLST of ‘core genome multilocus sequence typing). Het bleek mogelijk om met de ontwikkelde protocols en ‘pipeline’ de Listeria monocytogenes bacteriën te identificeren tot op cgMLST niveau. Er kon zelfs nog tot een dieper karakterisatieniveau gegaan worden. Met behulp van flow cells voor analyse van de complementaire streng en langere nanoporiën die de sequenties dubbel uitlezen, konden isolaten onderscheiden worden waarvan het genoom slechts enkele nucleotiden van elkaar verschilden. Voor Salmonella werd een ‘pipeline’ ontwikkeld waarmee 12 serovars geïdentificeerd konden worden.

In de bekomen genoomsequentie zelf kon met bepaalde algoritmes op zoek gegaan worden naar interessante genen zoals diegene die betrokken zijn bij bijvoorbeeld: gevoeligheid voor desinfectantia, biofilmvorming, stressreacties, virulentie en antibioticaresistentie. Er werd heel wat informatie over de eigenschappen van de geïsoleerde bacteriën bekomen.    

Deze resultaten tonen het potentieel van ‘nanopore’ sequencing voor het uitvoeren van microbiële analyses. Om de technologie binnen handbereik van voedingsbedrijven te brengen, is het belangrijk dat er specifieke protocols en ‘pipelines’ ontwikkeld worden met bio-informatica op maat van het beoogde doelorganisme (in het project waren dat Listeria monocytogenes stammen en Salmonella serovars). Een belangrijke noot is evenwel dat de resultaten in het project bekomen werden via  DNA-isolatie van geïsoleerde bacteriën.

Om ook complexere stalen te kunnen analyseren, die naast het doelorganisme ook nog DNA van andere organismen bevatten, zijn er verdere ontwikkelingen nodig. Voor biomedische toepassingen loopt er alvast veelbelovend onderzoek rond de ‘adaptive sampling’-benadering waarmee bijvoorbeeld met ‘nanopore’ sequencing weinig voorkomend DNA van pathogenen in bloedstalen van patiënten (veel voorkomend gastheer DNA) geïdentificeerd kan worden. Voorbeelden van dergelijke toepassingen van ‘nanopore sequencing’ voor metagenoom analyses zijn de projecten LeapSEQ en MetaTec. Hierdoor geïnspireerd voerden Howest en ILVO, aansluitend bij het SIPORE-project, alvast een succesvolle eerste test uit rond het detecteren van Listeria monocytogenes in een complexer microbieel mengsel  via ‘adaptive sampling’. Dit soort onderzoek kan op relatief korte termijn leiden tot toepassing van ‘nanopore’ sequencing op complexe agro-voedingsstalen.  

Referenties

• Wang Y., Zhao Y., Bollas A., Wang Y., Fai Au K. (2021). Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nature Biotechnology 39, 1348–1365 . https://doi.org/10.1038/s41587-021-01108-x 
• Project LeapSEQ: Efficiënte data processing oplossingen voor adaptieve en mobiele genoom sequencing, toegepast op monitoring van infectieziekten – Universiteit Antwerpen (abstract: FRIS onderzoeksportaal)
• Project MetaTec – Howest (abstract: Howest onderzoek)